El cromosoma Y forma, junto al cromosoma X, el sistema de determinación del sexo XY.

En los animales con este tipo de diferenciación sexual cromosómica, la sola presencia de pares cromosómicos XX significa la expresión genética que da por resultado un individuo hembra, mientras que la asociación y combinación XY significa la expresión genética que resulta en un individuo macho. Existe un gen en el cromosoma Y, denominado SRY (del inglés Sex-determining Region Y), que produce una proteína denominada TDF (del inglés, testis-determining factor), o factor determinador de los testículos, que es el responsable de que el embrión desarrolle los testículos y se convierta en masculino. No existe un gen equivalente para la diferenciación de los ovarios, de manera que el embrión será por defecto femenino a no ser que posea el mencionado gen.

Los gametos con cromosomas Y son producidos en las gónadas masculinas (los testículos), lo cual supone una activación a partir de hormonas; más precisamente a partir de un nivel suficiente de testosterona. De este modo se pueden hacer rastreos filogenéticos (muy precisos si se combinan con estudios con el ADN mitocondrial), ya que el cromosoma Y pasa exclusivamente de padre a hijo, a través de toda la progenie masculina. Si el espermatozoide que realiza la fecundación es portador del cromosoma X el bebé será niña (un X del padre y un X de la madre), pero si es Y será un varón.